石油煉化廢水處理技術
石油煉化廢水是汙染較嚴重和治理領域中處理難度較大的一類工業廢水，其特征是高氨氮，汙染物成份複雜、濃度高且多為生物難降解有毒有害有機物，水質、水量的波動幅度大。相比物理法和化學法，生物法具有去除汙染物的種類多，效率高、抗衝擊能力強、處理成本低等優點。目前，針對可生化性差、可生化利用率低的石油煉化廢水，石油煉化企業通常采用A2/O和A/O等常規生物脫氮工藝技術，但這些技術的氨氮去除負荷低、溶解氧消耗量大，而且由於硝化細菌世代周期長，上述單汙泥係統運行方式使氨氮硝化易受複雜的高濃度有機物影響，運行不穩定。新型處理技術，如臭氧氧化技術，電化學和光化學法與氧化劑(如H2O2,O3和Cl2等)結合使用的技術盡管對於汙水的處理和回用方麵存在一定的優勢，但由於能耗和處理費用較高，生產上尚未大量應用。
厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,ANAMMOX)是指在厭氧條件下微生物直接以NH4+為電子供體，以NO2-為電子受體的氧化還原反應，產物為N2。隨著水處理技術的不斷發展，厭氧氨氧化技術以其獨特的技術優勢受到國內外學者的關注。現階段國內對於石油煉化廢水的處理工藝研究主要集中在A/O生物法曝氣生物濾池((biological aerated filter, BAF)、臭氧一曝氣生物濾池、三元微電解-Fenton試劑氧化法、臭氧一固定化生物活性炭濾池和懸浮填料移動床生物膜法(moving bed biofilm re-actor, MBBR)等技術，但關於將厭氧氨氧化技術應用到石油煉化廢水的處理和探究對其菌群影響的研究較少。
本實驗利用已具有高效脫氮性能的厭氧氨氧化一反硝化細菌混培物建立生物脫氮反應器進行連續馴化實驗，旨在探究石油煉化廢水中COD和毒性物質對於脫氮處理應用過程中厭氧氨氧化一反硝化細菌混培物的影響。
1 實驗部分
1. 1實驗裝置
本實驗裝置由原水箱、上向流移動床厭氧氨氧化反應器、反應器進水泵三部分組成。原水箱總容積為20 L。反應器材質為有機玻璃，形式為圓筒形，內徑為42 mm，高為400 mm。反應器底部為厚度70 mm的承托層，由粒徑為2 - 20 mm砂礫石組成。承托層以上裝填80 mm高的由厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌為核心的細菌混培菌塊構成有效生化反應區。反應器的總容積0. 5 L，有效反應容積0. 11 L，運行方式采用上向流。反應器外表麵用黑塑料薄膜包裹，以防光線對細菌混培物的負麵影響。反應器進水泵為蠕動泵，額定流量為0.2-2.0 L/h。具體實驗裝置見圖1。
1. 2細菌來源
該反應器中所用厭氧氨氧化一反硝化細菌混培物取自已穩定運行6個月的厭氧氨氧化生物濾池反應器。生物濾池運行工況:進水溫度33℃，進水基質濃度NH4+ -N 200 mg / L ( NO2- -N與NH4+ -N濃度比為1. 0一1.3),TN去除負荷為13. 5 kg · ( m3·d)-1，三氮化學計量比為NH4+ -N去除量:NO2- -N去除量:NO3- -N產生量=1:1 .34:0. 20。
1. 3實驗原水
實驗原水采用人工配製，由石油煉化廢水和基礎配製原水兩部分組成，石油煉化廢水取自天津市大港區某石化企業氣浮池出水，基本組分為:NH4+ -N濃度為80 mg / L , pH為7.45,COD濃度為675 mg / L ;基礎配製原水由脫除餘氯的自來水、NH4 Cl , NaNO2 ,KH2PO4、FeCl3·6H2O和NaHCO3等組成。
配製方法:不同階段配製的實驗原水成分為NH4+ -N濃度278. 28一229. 93 mg / L; NO2- -N濃度201. 51 - 319. 55 mg / L ( NH4+ -N和NO2- -N的濃度據實驗要求按需配製且比例控製在1:1.3左右);KH2PO4濃度10 mg / L; NaHCO3濃度200mg / L;FeCl3· 6H2O濃度4.0 mg / L;COD由石油煉化廢水帶入，不需另行投加。原水的pH值采用2. 0 mol / L的HCl進行調節。原水配製過程中，為了補充微量元索，另投加體積分數0. 17%的滅菌生活汙水。原水成分及反應器運行條件見表1。
1. 4實驗方法
實驗裝置進水流量為0. 4 L / h，水溫為(29士1) ℃，通過控製石油煉化廢水的添加比例並采用連續進水的方式，將NO2- -N與NH4+-N濃度比控製在1. 30左右。通過不同階段石油煉化廢水的添加，實現在不斷增大難降解COD及毒性物質濃度的情況下，考察以厭氧氨氧化一反硝化細菌為核心的細菌混培物在脫氮生化過程中對COD和毒性物質的耐受能力。同時，以第I階段中NH4+-N去除量和第II階段中反硝化總脫氮量分別作為衡量厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌活性指標和變化標準，探究石油煉化廢水中COD及毒性物質對厭氧氨氧化一反硝化細菌混培物的影響。
另外，采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)技術與倍比稀釋法(most probable num-ber, MPN)相結合的MPN-PCR技術，對馴化前後兩類主要細菌進行計數，探究馴化前後菌群的數目變化情況。
考慮到反應體係的水力停留時間為1. 25 h，而針對該反應體係，重點考察的是石油煉化廢水對於細菌混培物的影響而非脫氮效率，所以實驗中未控製最終出水指標。
1. 5分析項目及檢測方法
實驗分析過程中涉及到的分析項目及檢測方法見表2。
MPN-PCR技術將聚合酶鏈式反應技術與倍比稀釋法相結合，選取不同稀釋梯度的樣品分別做4組不同稀釋度的16個平行樣進行PC R擴增，根據擴增產物特征堿基序列的電泳條帶確定陽性反應，結果用來計算各樣品的陽性反應數確定數量指標，然後從MPN統計計算表中查出相應的細菌近似數。
1. 6數據處理及分析方法
當采用分光光度法檢測COD時，由於實驗原理中采用氧化劑和助催化劑，水樣中的還原性物質會與氧化劑進行反應，所以測定時，NO2- -N可被氧化劑氧化而使測定值比實際值偏高，因此水樣實際COD應扣除由NO2- -N所導致的COD誤差。在水樣COD濃度計算中，采用式(1)的數據處理方法以消除NO2- -N的影響。
當采用MPN-PCR結果進行分析計算時，按照MPN法的計數原則，計算樣品中的細菌數量:統計出現擴增條帶的最後3個連續的稀釋度(10^x、10^x+1和10^x+2)，根據這3個稀釋度平行樣中條帶的個數作為數量指標(abc )，從“每毫升稀釋液的細菌近似值”MPN表中查詢對應的數值，采用式(2)的計算公式來計算細菌數量。
每克菌塊中的細菌數量(個/ g)=(條帶數量指標對應的數值x最後3個稀釋度中第1個稀釋度的稀釋倍數x提取的DNA總量)/菌塊質量(2)
2結果分析
2. 1馴化過程對脫氮過程的影響
厭氧氨氧化反應可能是厭氧氨氧化細菌主要能量代謝途徑，所以反應生化活性主要體現在NH4+-N去除濃度值的變化上。反硝化細菌在反硝化反應中可以利用多種代謝途徑獲取能量，所以反應生化活性主要體現在反硝化總脫氮量(NO2- -N和NO3- -N )上。根據實驗方法中建立的標準，分析石油煉化廢水中COD和毒性物質對於細菌混培物的影響。各階段的厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌的生化活性見表3。
2.1.1第I一II階段
圖2所示為第I一II階段的脫氮影響。實驗第I階段為細菌混培物的適應期，所以采用與菌種原有環境相同(生物濾池運行工況)以縮短適應時間、保障處理效果。該階段實驗原水中沒有添加石油煉化廢水，從NH4+-N與NO2- -N去除值可以看到厭氧氨氧化反應相對穩定，此時的TN去除負荷為11. 978 kg·(m3·d)，而反硝化細菌總脫氮量相對較小，所以該階段的細菌混培物中主要體現厭氧氨氧化細菌生化活性，而反硝化細菌生化活性存在但不明顯。
第II階段是馴化實驗的初始階段，石油煉化廢水的添加比例較小，原水中COD和毒性物質濃度均較低。從圖2中可以看到，該階段中NH4+-N與NO2- -N的平均去除值分別增加了1. 643和7. 052 mg / L，反硝化平均總脫氮量卻增加了3. 56倍，同時以吸附作用和反硝化反應為主的去除方式可去除原水COD的61. 1%左右，其中反硝化反應的去除比例占到45%左右。對於由厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌組成的協同脫氮係統，添加的COD對反硝化反應產生了明顯的促進作用，而對於厭氧氨氧化反應影響不大，說明該脫氮係統增強了對COD的抗衝擊能力。
2. 1. 2第III一V階段
從圖3和4可以看出，第III一V階段中伴隨著石油煉化廢水添加比例的增大，原水中COD和毒性物質濃度逐漸增加。進行分析時，以第I階段中NH4+-N除量作為NH4+-N理論去除值，以第II階段中反硝化總脫氮量作為反硝化理論總脫氮量，並以此分別作為衡量厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌活性指標和變化標準。
對於厭氧氨氧化細菌，NH4+-N去除平均值出現降低並且變化量逐漸增大，與NH4+-N理論去除值之間的差距依次增大，並且3個階段內的NH4+-N去除值均出現了波動，但穩定性卻越來越好。說明該階段中厭氧氨氧化細菌生化活性已經出現了明顯的降低且降幅逐漸增大，也表現在整體TN去除負荷依次降低。由於實驗出水中厭氧氨氧化反應的底物NH4+-N和NO2- -N均有剩餘，所以不斷添加的石油煉化廢水中COD和毒性物質對於厭氧氨氧化細菌產生了明顯的不利影響，但隨著馴化階段的進行，細菌混培物對水質產生了一定的適應性;對於反硝化細菌，利用原水中COD進行反應後，細菌生化活性出現了明顯增強且脫氮量逐漸增大，但相比反硝化理論總脫氮量的差距越來越大，第V階段的差量約是第III階段的2倍，推測由於石油煉化廢水添加比例的不斷增大，原水中的COD和毒性物質濃度均增大，而進水中可利用的NO2- -N和NO3- -N充足，所以COD濃度的增大一定程度上對於反硝化細菌產生了有利影響，但毒性物質濃度的增加對反硝化細菌產生了明顯的負麵作用。
另外，從表3中可以看出，第V階段細菌混培物中厭氧氨氧化細菌生化活性達到最低點而反硝化細菌生化活性達到最高點，推測原因:一方麵是該階段毒性物質作用顯著，厭氧氨氧化細菌的世代時間較長(約為11 d)，使得死亡率大於生長率，所以厭氧氨氧化活性出現了明顯下降，並且2種細菌之間產生競爭和相互影響;另一方麵由於高濃度COD對厭氧氨氧化細菌產生了明顯衝擊作用，反硝化細菌卻可以利用部分COD保持正常的繁殖速率，使得生長率大於毒性物質造成的死亡率，所以反硝化細菌的數量增加對總體生化活性影響不明顯，並且此時的混培體係中反硝化細菌相對厭氧氨氧化細菌逐漸成為了優勢菌種。
2. 1. 3第VI階段
第VI階段全部由石油煉化廢水組成，原水中高濃度的COD和毒性物質均未經過稀釋。從圖5和表3中看出NH4+-N平均去除值相比上一階段增加，階段內NH4+-N去除值出現波動，並且與NH4+-N理論去除值之間的差距逐漸增大;反硝化平均總脫氮量相比上一階段減少，階段內反硝化總脫氮量同樣波動明顯。說明該階段中高濃度COD和毒性物質對於細菌混培物中的厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌均產生了明顯的不利影響，但由於長時間的運行可能出現了厭氧氨氧化細菌數量的增加或細菌適應性的加強，所以反硝化細菌生化活性可以表現在反硝化平均脫氮量上，脫氮量減少了25.6%，而厭氧氨氧化細菌生化活性則可以表現在氨氮的平均去除值上，增加了2. 491 mg / L。
2. 2馴化過程對菌群的影響
采用分子生物學技術(MPN-PCR)對菌群在馴化階段前後的變化進行分析，該方法最大的優點在於可以通過進行PCR體外快速擴增靶序列來取代細菌的分離培養，不但極大地縮短了實驗時間，而且對樣品中不可培養的細菌種類也可進行計數，從而使得結果更接近實際數量。
本實驗首先在DNA提取方麵嚐試了改進的十六烷基三甲酸澳化錢( Hexadecyl trimethyl ammoniumBromide , CTAB ) /NaCI化學裂解法、改進的傳統蛋白酶K一十二烷基磺酸鈉( Sodium dodecyl sulfate ,SDS)一氯仿異戊醇法(CPSCI法)和改進的溶菌酶-SDS-蛋白酶K細胞裂解法3種提取方法，采用紫外分光光度法對提取的DNA進行定量測定，分別測定260 nm和280 nm的吸光度值，提取DNA的完整性需要通過瓊脂糖電泳進行檢驗。經瓊脂糖電泳驗證，3種方法提取的DNA長度均為23 kb左右，條帶輪廓清晰，亮度適宜，沒有明顯的彌散現象，表明提取的細菌基因組DNA質量較高，適用於後續實驗。吸光度值測量使用UV-2550紫外分光光度計，測量結果如表4。由表4可以看出3種方法的A260/A280比值都大於1.8,蛋白質去除效率和DNA提取質量較高，3種方法均能夠很好的去除蛋白質等有機雜質。雖然存在一定程度的RNA幹擾，但並不影響後續PCR的操作。所有3種方法都不需要進行純化，可以直接得到PCR擴增產物，說明這3種方法提取DNA是可行的。從提取的DNA濃度和純度兩方麵，綜合考慮最終確定蛋白酶K-SDS法作為提取細菌混培物DNA的方法。
細菌混培物中的厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌擴增所使用的引物見表5,PCR擴增采用25 μL體係，各組分:PCR buffer 2. 5 μL, MgCl2 2 μL, dNTP 0. 5 μL，上下遊引物各1 μL , Taq聚合酶0. 2 μL上海生工合成)，模板1 μL，無菌雙蒸水補足至25 μL。
PCR擴增采用降落PCR ( Touchdown PCR, TD-PCR)技術，采用的擴增程序為:1)厭氧氨氧化細菌:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,60℃退火40 s,72℃延伸40 s，每個循環退火溫度降低0. 3℃，以上步驟循環25次;94 ℃變性30 s,55℃退火30 s,72 ℃延伸40 s，以上步驟循環10次;72 ℃延伸10min ; 2)反硝化細菌:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min，每個循環退火溫度降低1. 0 ℃，以上步驟循環10次;95 ℃變性30 s,50 ℃退火40 s , 72 ℃延伸1 min，以上步驟循環20次;72 ℃延伸10 min。
經過一係列實驗方法和條件的嚐試、摸索和優化，得到適用於該細菌混培物最適的DNA提取、PCR擴增和MPN計數相結合體係。圖6所示是細菌混培物中厭氧氨氧化和反硝化細菌在馴化實驗前後計數的電泳圖。
通過計算得到馴化前的厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌數量為7. 549 x 10^14和3. 523 x 10^6個/ g，馴化後的數量分別為8. 212 x 10^8和4. 693 x 10^16個/ g。對比2種細菌在馴化前後的數量，可以看出對於厭氧氨氧化細菌來說，厭氧氨氧化反應可能是厭氧氨氧化細菌主要能量代謝途徑，由於世代時間長(約為11 d)、反硝化細菌數量的增加和毒性物質作用的原因，造成厭氧氨氧化細菌數量明顯減少和生化活性降低。而對於反硝化細菌來說，由於反應可以利用多種代謝途徑獲取能量，所以基質對細菌的影響相對較小，並且利用石油煉化廢水中的COD在細菌增殖上沒有受到影響而使數量增加，但毒性物質對於反硝化細菌的生化活性產生了明顯的抑製。
3結論
1)厭氧氨氧化細菌和反硝化細菌的混培脫氮體係的脫氮生化活性並未與細菌數目的變化情況呈正相關性變化，說明COD和毒性物質產生了不同程度的影響。
2)厭氧氨氧化細菌比反硝化細菌對於石油煉化廢水毒性的作用更敏感。由於厭氧氨氧化細菌本身世代周期長，所以初期毒性負效應作用較明顯，但經馴化後厭氧氨氧化細菌對於高濃度COD和高毒性物質具有一定的適應性。在石油煉化廢水處理中，通過進水負荷的控製，可以實現高於目前常用工藝技術的脫氮效率並實現節能。
3)混培脫氮體係在一定程度上可有效地抵抗石油煉化廢水高濃度COD、高毒性物質對於厭氧氨氧化生理、生化脫氮過程的負麵影響。反硝化細菌的存在對於厭氧氨氧化脫氮體係的穩定和出水總氮指標的降低，具有較好的促進和保障作用。